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腫瘤壞死因子相關激活誘導因子測定試劑盒說明書

試驗盒原理：
ES試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知ES濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將ES和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中ES的濃度呈比例關系。

試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

操作步驟：
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

4、敏感度： 0.1 pg/ml。

結果判斷與分析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的ES標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的ES含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3、檢測值范圍：0-240pg/ml

操作注意事項：
1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

ELISA常見問題與解決方法

1. 陰性對照出現陽性結果

① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當導致相鄰孔之間溶液濺灑出現交叉污染——更換試劑，小心操作。

② 酶標板洗滌不徹底——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒滿板孔，確保能充分洗滌。

③ 抗體量過多導致非特異性結合——根據說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當濃度。

2．酶標板整體背景高

① 抗體非特異性結合——應確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當的封閉液以防止非特異性結合。

② 底物結合濃度過高——對底物進行適當稀釋。

③ 反應時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數時立即使用終止液終止反應，適當縮短顯色時間。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液應是澄清透明的，若出現黃色或其他顏色表明受到污染，應更換新的底物溶液。

⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應在避光條件下進行。

3. 復孔之間重復性差

① 樣品數量不整齊，加樣時間有長有短——加重復孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。

② 加樣量不一致——樣品稀釋前應充分混勻，并且使用同一移液槍。

③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復測定樣品時，操作條件、人員應盡可能與上次保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低

① 樣品中待測抗原含量太低會導致測定結果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

② 加入抗體量不合適會造成結果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結果更好盡可能調整抗體的最適用量。

③ 孵育時間太短導致檢測結果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結合。

④ 孵育溫度不適合——應保證抗體在最適宜條件下進行孵育（一般37℃孵育1h）。