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PCR實驗前準備事項
日期：2025-04-20 06:31
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摘要：PCR實驗前準備事項
在開始PCR實驗之前，必須準備好DNA模板（基因組DNA或逆轉錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設計或用軟件設計），并選擇合適的商業酶（選擇符合您實驗目的的酶)
1.DNA聚合酶。有許多商業 DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對沒有任何突變的特定 DNA 片段進行 PCR，請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在，就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對T-vector連接的片段進行PCR，要注意，因為大多數高保真聚合酶的產物都沒有A-tailing，所以應該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實驗后添加A-tailing。
2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設計對 PCR 擴增的成功至關重要。當您開始設計引物時，應仔細考慮以下幾個原則：
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內的引物 Tm 是合適的。
③GC 含量。合適 GC 含量應為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設計，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。