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PCR檢測實驗引物退火溫度詳述
日期：2025-04-19 11:04
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摘要：
退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的zui適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G+C）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基...
退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的zui適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G+C）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基的引物，如果（G+C）%含量為50%時，則Ta的起點可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時間退火沒有必要。