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單層貼壁細胞總蛋白的提取
日期：2025-04-20 06:51
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摘要：單層貼壁細胞總蛋白的提取：
1.倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將 PBS 棄凈后把培養瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂...
單層貼壁細胞總蛋白的提取：
1.倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將 PBS 棄凈后把培養瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
5.裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機預冷）
7.將離心后的上清分裝轉移倒 1.5 ml 的離心管中放于-20℃ 保存。
（個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶 T-75的細胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。）
（注：先用預冷的PBS（一般數毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用細胞刮刮下細胞，轉移至1.5 ml 的離心管中，離心得細胞，加裂解液冰上裂解30分鐘期間震蕩數次，離心，超聲裂解，離心，取上清）
1.倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將 PBS 棄凈后把培養瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
5.裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機預冷）
7.將離心后的上清分裝轉移倒 1.5 ml 的離心管中放于-20℃ 保存。
（個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶 T-75的細胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。）
（注：先用預冷的PBS（一般數毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用細胞刮刮下細胞，轉移至1.5 ml 的離心管中，離心得細胞，加裂解液冰上裂解30分鐘期間震蕩數次，離心，超聲裂解，離心，取上清）